本期為您推薦天津科技大學路福平教授團隊發表在《Bioresource Technology》上的一篇文章：Multidimensional combinatorial screening for high-level production of erythritol in Yarrowia lipolytica。
作者采用了一種多維度組合篩選策略，包括基于生長耦合生物傳感器的適應性進化篩選平臺（EVOL cell）以及代謝網絡重構，實現快速篩選能夠高效利用粗甘油生產赤蘚糖醇的突變菌株，為生物基產品的開發提供了新的思路和方法。
解脂耶氏酵母（Yarrowia lipolytica）作為一種被廣泛研究的宿主菌株，工程化改造后能夠將生物柴油行業的副產品粗甘油酯轉化為赤蘚糖醇，實現其高值化利用，但其生產效率有待提高。因此，需對解脂耶氏酵母的代謝網絡進行重構，以實現其工業化應用。
然而，對代謝網絡復雜調控細節的了解不足仍然是一個重大挑戰。研究者認為需通過多維組合篩選不斷挖掘非直觀的目標基因，而隨機誘變和適應性實驗室進化是提高宿主菌株代謝性能的有效方法，因此研究者構建了一套包括生長偶聯的適應性實驗室進化和代謝網絡重構在內的多維組合篩選策略。
本研究利用基于Eryd轉錄調控因子和其DNA結合序列的生物傳感器，構建了響應赤蘚糖醇的熒光偶聯生物傳感器，實現了解脂耶氏酵母中赤蘚糖醇水平的動態檢測。
圖1 赤蘚糖醇生物傳感器的構建和優化
隨后將 LEU2 基因替代 DsRed 基因，以細胞生長表型作為輸出信號，構建了生長偶聯的生物傳感器。利用ARTP誘變育種儀對含有生長偶聯生物傳感器的解脂耶氏酵母進行誘變，并通過可實時監測菌株生長條件的EVOL cell自動連續培養篩選突變體，完成全自動適應性進化。
EVOL cell是基于高氣體透過性微管路及單相微流控技術開發而成的微生物馴化裝備，具有環境氧分壓調控、溫度控制、化學因子梯度添加等多種適應性進化策略，可滿足不同實驗需求，靈活調整壓力條件，全自動進行單因素或多因素實驗。
突變株在EVOL cell中進行了長達48天的連續監測和自動連續培養，全程無需人工值守。經過5個適應階段的富集（篩選介質中亮氨酸濃度從100 mM逐漸降低到0 mM），最終篩選出了14個具有大型菌落的突變菌株G02-15。在250 mL搖瓶發酵中評估這些突變菌株的赤蘚糖醇生產性能，結果顯示，G12菌株赤蘚糖醇滴度最高（62.4 g/L），是對照菌株G01的4.4倍。
隨后對G12進行基因組測序及反向工程，發現SMF1、NADPH脫氫酶和ER1 D46A（M1）突變對赤蘚糖醇合成有積極影響。
圖2 開發基于生長偶聯生物傳感器和 EVOL cell篩選平臺
隨后進一步對赤蘚糖醇生物合成的代謝網絡進行重構。先對關鍵酶進行分子修飾，通過迭代組合突變法，提高赤蘚糖醇還原酶 ER1 的催化活性。隨后敲除分解赤蘚糖醇的基因，過表達與甘油同化及前體供應相關的基因，進行代謝網絡重構。最終得到的菌株G31赤蘚糖醇滴度顯著提升了83.5 g/L。
圖3 ER基因的分子改造
圖4 工程菌株赤蘚糖醇生產性能的評價
最后于5L生物反應器中，G31菌株的細胞密度和廢棄甘油消耗、赤蘚糖醇滴度、生產率和產率均高于G01菌株。其中G31菌株的赤蘚糖醇滴度達到了220.5 g/L，生產率為1.8 g/L/h，產率為0.6 g/g廢棄甘油。
本研究為基于生物傳感器的解脂耶氏酵母超高通量篩選策略提供了有價值的指導。也展現出了天木生物ARTP+EVOL cell在適應性進化及非直觀目標基因挖掘方向的強大潛能。
論文鏈接：https://doi.org/10.1016/j.biortech.2024.131035
本期為您推薦天津科技大學路福平教授團隊發表在《Bioresource Technology》上的一篇文章：Multidimensional combinatorial screening for high-level production of erythritol in Yarrowia lipolytica。
作者采用了一種多維度組合篩選策略，包括基于生長耦合生物傳感器的適應性進化篩選平臺（EVOL cell）以及代謝網絡重構，實現快速篩選能夠高效利用粗甘油生產赤蘚糖醇的突變菌株，為生物基產品的開發提供了新的思路和方法。
解脂耶氏酵母（Yarrowia lipolytica）作為一種被廣泛研究的宿主菌株，工程化改造后能夠將生物柴油行業的副產品粗甘油酯轉化為赤蘚糖醇，實現其高值化利用，但其生產效率有待提高。因此，需對解脂耶氏酵母的代謝網絡進行重構，以實現其工業化應用。
然而，對代謝網絡復雜調控細節的了解不足仍然是一個重大挑戰。研究者認為需通過多維組合篩選不斷挖掘非直觀的目標基因，而隨機誘變和適應性實驗室進化是提高宿主菌株代謝性能的有效方法，因此研究者構建了一套包括生長偶聯的適應性實驗室進化和代謝網絡重構在內的多維組合篩選策略。
本研究利用基于Eryd轉錄調控因子和其DNA結合序列的生物傳感器，構建了響應赤蘚糖醇的熒光偶聯生物傳感器，實現了解脂耶氏酵母中赤蘚糖醇水平的動態檢測。
圖1 赤蘚糖醇生物傳感器的構建和優化
隨后將 LEU2 基因替代 DsRed 基因，以細胞生長表型作為輸出信號，構建了生長偶聯的生物傳感器。利用ARTP誘變育種儀對含有生長偶聯生物傳感器的解脂耶氏酵母進行誘變，并通過可實時監測菌株生長條件的EVOL cell自動連續培養篩選突變體，完成全自動適應性進化。
EVOL cell是基于高氣體透過性微管路及單相微流控技術開發而成的微生物馴化裝備，具有環境氧分壓調控、溫度控制、化學因子梯度添加等多種適應性進化策略，可滿足不同實驗需求，靈活調整壓力條件，全自動進行單因素或多因素實驗。
突變株在EVOL cell中進行了長達48天的連續監測和自動連續培養，全程無需人工值守。經過5個適應階段的富集（篩選介質中亮氨酸濃度從100 mM逐漸降低到0 mM），最終篩選出了14個具有大型菌落的突變菌株G02-15。在250 mL搖瓶發酵中評估這些突變菌株的赤蘚糖醇生產性能，結果顯示，G12菌株赤蘚糖醇滴度最高（62.4 g/L），是對照菌株G01的4.4倍。
隨后對G12進行基因組測序及反向工程，發現SMF1、NADPH脫氫酶和ER1 D46A（M1）突變對赤蘚糖醇合成有積極影響。
圖2 開發基于生長偶聯生物傳感器和 EVOL cell篩選平臺
隨后進一步對赤蘚糖醇生物合成的代謝網絡進行重構。先對關鍵酶進行分子修飾，通過迭代組合突變法，提高赤蘚糖醇還原酶 ER1 的催化活性。隨后敲除分解赤蘚糖醇的基因，過表達與甘油同化及前體供應相關的基因，進行代謝網絡重構。最終得到的菌株G31赤蘚糖醇滴度顯著提升了83.5 g/L。
圖3 ER基因的分子改造
圖4 工程菌株赤蘚糖醇生產性能的評價
最后于5L生物反應器中，G31菌株的細胞密度和廢棄甘油消耗、赤蘚糖醇滴度、生產率和產率均高于G01菌株。其中G31菌株的赤蘚糖醇滴度達到了220.5 g/L，生產率為1.8 g/L/h，產率為0.6 g/g廢棄甘油。
本研究為基于生物傳感器的解脂耶氏酵母超高通量篩選策略提供了有價值的指導。也展現出了天木生物ARTP+EVOL cell在適應性進化及非直觀目標基因挖掘方向的強大潛能。
論文鏈接：https://doi.org/10.1016/j.biortech.2024.131035
