前言
微生物個(gè)體微小、構(gòu)造簡單、進(jìn)化地位低、分布區(qū)域廣，在不同的生存環(huán)境進(jìn)化形成了各具特色的生態(tài)系統(tǒng)。土壤微生物的群落結(jié)構(gòu)特征的相關(guān)分析對(duì)從土壤微生態(tài)方面降低作物種植成本、提高品質(zhì)具有重要實(shí)踐意義。同時(shí)復(fù)雜的生存環(huán)境為土壤微生物帶來了豐富的生物多樣性和獨(dú)特的生化機(jī)制以及代謝途徑，使其在新型生物活性物質(zhì)的生產(chǎn)方面擁有著巨大的潛力。
但從復(fù)雜的土壤微生物菌群中篩選出合適的菌株始終是一個(gè)工作量比較大的任務(wù)。傳統(tǒng)方法篩選菌種的一般步驟為：菌種采集→富集培養(yǎng)→純種分離→性能測定→菌種保藏，該方法步驟繁瑣、耗時(shí)較久，需要投入巨大的工作量和重復(fù)勞動(dòng)。因此為了增加篩選效率，科研人員不斷的去構(gòu)建新型的篩選理論和自動(dòng)化設(shè)備，諸多方法也已經(jīng)成功的被應(yīng)用在了土壤微生物的篩選領(lǐng)域，如變性梯度凝膠電泳法、實(shí)時(shí)熒光定量 PCR和微陣列等。
天木生物高通量微升級(jí)液滴培養(yǎng)組學(xué)系統(tǒng)（single cell microliter-droplet culture omics system, MISS cell culture omics）是基于液滴微流控技術(shù)開發(fā)的微型化高通量單細(xì)胞培養(yǎng)及分選裝備，可以實(shí)現(xiàn)對(duì)環(huán)境菌群在單細(xì)胞水平上進(jìn)行分離培養(yǎng)，液滴生成后存儲(chǔ)于高透氣性管路中進(jìn)行孵育，最后通過光學(xué)信號(hào)（OD、熒光、化學(xué)發(fā)光等）進(jìn)行檢測分選，分選后的液滴進(jìn)入多孔板中，用于后續(xù)實(shí)驗(yàn)。
實(shí)驗(yàn)過程
本案例使用天木生物高通量微升級(jí)液滴培養(yǎng)組學(xué)系統(tǒng)作為基礎(chǔ)構(gòu)建了土壤微生物的高效篩選模型。
本次實(shí)驗(yàn)樣本為野外土壤，稱取2g樣品，加入5倍體積的生理鹽水和玻璃珠，4℃過夜震蕩。靜置沉降后取上清，用血球板計(jì)數(shù)，根據(jù)上清中菌含量稀釋成3個(gè)濃度梯度（樣品A，B，C），上機(jī)生成液滴，室溫培養(yǎng)。同時(shí)按照MISS cell上樣濃度的5倍分別制成樣品D、E、F，涂平板，室溫培養(yǎng)并統(tǒng)計(jì)菌落數(shù)。
液滴盤培養(yǎng)15-45天，從60882個(gè)液滴分選出帶菌液滴5628個(gè)，同時(shí)涂布平板共88個(gè)，統(tǒng)計(jì)菌落數(shù)共761個(gè)。測序結(jié)果顯示：原始土壤中共檢測出1264種菌，液滴體系中共檢測出86種菌，平板體系共檢測出73種菌（圖2）。其中液滴中鑒定出50多種未能在平板中獲得的菌株，包括布魯氏菌、缺陷短波單胞菌等7大類的菌只在液滴中富集。同時(shí)由于液滴是單細(xì)胞包裹后培養(yǎng)，收集液滴中超過95%是可以進(jìn)行鑒定后保藏。
結(jié)論
本案例以OD閾值作為篩選依據(jù)，對(duì)土壤中的多種微生物進(jìn)行了有效分離，并成功檢測出了86株不同的微生物，比傳統(tǒng)方法篩選種類高了17.8%，同時(shí)大大降低人工成本。該方法證明了微流控篩選系統(tǒng)在土壤微生物分離中的有效性。
圖1 土壤微生物篩選實(shí)驗(yàn)流程
圖2 原始土樣、液滴和平板富集的細(xì)菌測序結(jié)果
圖3 原始土樣、液滴和平板富集的細(xì)菌種類差異
前言
微生物個(gè)體微小、構(gòu)造簡單、進(jìn)化地位低、分布區(qū)域廣，在不同的生存環(huán)境進(jìn)化形成了各具特色的生態(tài)系統(tǒng)。土壤微生物的群落結(jié)構(gòu)特征的相關(guān)分析對(duì)從土壤微生態(tài)方面降低作物種植成本、提高品質(zhì)具有重要實(shí)踐意義。同時(shí)復(fù)雜的生存環(huán)境為土壤微生物帶來了豐富的生物多樣性和獨(dú)特的生化機(jī)制以及代謝途徑，使其在新型生物活性物質(zhì)的生產(chǎn)方面擁有著巨大的潛力。
但從復(fù)雜的土壤微生物菌群中篩選出合適的菌株始終是一個(gè)工作量比較大的任務(wù)。傳統(tǒng)方法篩選菌種的一般步驟為：菌種采集→富集培養(yǎng)→純種分離→性能測定→菌種保藏，該方法步驟繁瑣、耗時(shí)較久，需要投入巨大的工作量和重復(fù)勞動(dòng)。因此為了增加篩選效率，科研人員不斷的去構(gòu)建新型的篩選理論和自動(dòng)化設(shè)備，諸多方法也已經(jīng)成功的被應(yīng)用在了土壤微生物的篩選領(lǐng)域，如變性梯度凝膠電泳法、實(shí)時(shí)熒光定量 PCR和微陣列等。
天木生物高通量微升級(jí)液滴培養(yǎng)組學(xué)系統(tǒng)（single cell microliter-droplet culture omics system, MISS cell culture omics）是基于液滴微流控技術(shù)開發(fā)的微型化高通量單細(xì)胞培養(yǎng)及分選裝備，可以實(shí)現(xiàn)對(duì)環(huán)境菌群在單細(xì)胞水平上進(jìn)行分離培養(yǎng)，液滴生成后存儲(chǔ)于高透氣性管路中進(jìn)行孵育，最后通過光學(xué)信號(hào)（OD、熒光、化學(xué)發(fā)光等）進(jìn)行檢測分選，分選后的液滴進(jìn)入多孔板中，用于后續(xù)實(shí)驗(yàn)。
實(shí)驗(yàn)過程
本案例使用天木生物高通量微升級(jí)液滴培養(yǎng)組學(xué)系統(tǒng)作為基礎(chǔ)構(gòu)建了土壤微生物的高效篩選模型。
本次實(shí)驗(yàn)樣本為野外土壤，稱取2g樣品，加入5倍體積的生理鹽水和玻璃珠，4℃過夜震蕩。靜置沉降后取上清，用血球板計(jì)數(shù)，根據(jù)上清中菌含量稀釋成3個(gè)濃度梯度（樣品A，B，C），上機(jī)生成液滴，室溫培養(yǎng)。同時(shí)按照MISS cell上樣濃度的5倍分別制成樣品D、E、F，涂平板，室溫培養(yǎng)并統(tǒng)計(jì)菌落數(shù)。
液滴盤培養(yǎng)15-45天，從60882個(gè)液滴分選出帶菌液滴5628個(gè)，同時(shí)涂布平板共88個(gè)，統(tǒng)計(jì)菌落數(shù)共761個(gè)。測序結(jié)果顯示：原始土壤中共檢測出1264種菌，液滴體系中共檢測出86種菌，平板體系共檢測出73種菌（圖2）。其中液滴中鑒定出50多種未能在平板中獲得的菌株，包括布魯氏菌、缺陷短波單胞菌等7大類的菌只在液滴中富集。同時(shí)由于液滴是單細(xì)胞包裹后培養(yǎng)，收集液滴中超過95%是可以進(jìn)行鑒定后保藏。
結(jié)論
本案例以OD閾值作為篩選依據(jù)，對(duì)土壤中的多種微生物進(jìn)行了有效分離，并成功檢測出了86株不同的微生物，比傳統(tǒng)方法篩選種類高了17.8%，同時(shí)大大降低人工成本。該方法證明了微流控篩選系統(tǒng)在土壤微生物分離中的有效性。
圖1 土壤微生物篩選實(shí)驗(yàn)流程
圖2 原始土樣、液滴和平板富集的細(xì)菌測序結(jié)果
圖3 原始土樣、液滴和平板富集的細(xì)菌種類差異
